信號弱

如果抗體染色信號弱或無信號，可能是由于以下原因引起的：

1、抗體儲存

確保你的抗體保存在4℃并且避光。如果抗體結合了熒光素，那么千萬不要冷凍保存，因為這可能會導致熒光抗體的沉淀和聚集。還有，要確?？贵w沒有過期。

2、稀釋

你是不是一直在用廠家推薦的量做實驗？你可能需要進行抗體滴定找到最佳抗體用量。

詳見：

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-42-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1755-1-1.html

3、儀器--濾光片設置

確保流式機器配置有合適的、能夠檢測到你所用熒光的激光和濾光片。例如Brilliant Violet? 570需要紫光激光器和585/42的濾光片，如果你用了525/50濾光片，那么就檢測不到信號了。

不同熒光有不同的發(fā)射譜，為了檢測到信號，需要配置有能夠捕捉到該波長信號的濾光片。在上面的例子中，525/50濾光片只能捕捉500~550nm的信號，而BV570的峰值波長在570nm，超出了范圍，故無法被該濾光片檢測到。

還有需要了解每根激光有多少個光電倍增管（PMT），如果紫光激光器只有3個PMT，那么你想檢測4色就不可能了。

4、儀器--激光性能

如果流式細胞儀的激光沒有很好的校準，那么就可能導致某些通道（或所有通道）信號弱。使用一些校準微球可以很方便地檢查儀器性能。所以記得按照流式細胞儀廠家的指導定期進行質量控制和優(yōu)化檢查。

5、抗原表達--表達密度

某些抗原本身就表達非常弱，或者只有非常少的細胞群體表達，此時，表達弱就是正常的?？梢試L試選擇強的熒光素或選擇SI值高的抗體（參見：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4167-1-1.html）

6、抗原表達--細胞特異性

有些單倍型特異性標記只表達在某些系別的小鼠上，所以購買抗體前需要詳細閱讀抗體說明。例如小鼠H-2K、I-A、CD90和CD45。

而且，流式細胞術基于逐級設門，如果門一開始設錯了，也可能影響最后的分析結果，導致假性弱表達。

7、抗原表達--表達位置

要知道，有些抗原表達在細胞表面、有些表達在胞漿、細胞器內、胞核，甚至有些所有部位都表達。所以需要采用合適的方法學去檢測。

8、抗原表達--誘導

有些抗原在活化后發(fā)生下調，而有些標記和細胞因子則需要誘導才能表達（參見：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html），如果你不經(jīng)過誘導就檢測這些標記或細胞因子，就會出問題。

9、緩沖液

你實驗使用的緩沖液是否正確？例如Biolegend的FoxP3在他們自家的foxP3緩沖液中性能良好，但如果換了其它家的緩沖液，可能就檢測不出來了。同樣，其它廠家大多也是如此。固定和破膜緩沖液也十分重要。

10、二抗

如果你一抗用了純化或生物素標記的抗體，那么二抗是否用了正確的抗體？例如一抗用了Rat Anti-mouse，那么你的二抗應該用Goat Anti-Rat，同時應該用只加二抗的管子作為空白對照檢測背景熒光。

還有，你應該檢測一下二抗是否還會跟其它一抗發(fā)生反應，這有助于發(fā)現(xiàn)是一抗還是二抗的問題。

11、固定

你是否在染色前固定或破膜了？固定和破膜能夠改變抗原表位和抗體的相互作用，這種敏感性是抗原依賴性和克隆依賴性的。例如HIT2 (human CD38), 5C3 (human CD40), BC96 (human CD25)這幾個表位通常在去污劑或甲醇處理后是不穩(wěn)定的。而有些抗原位點則需要固定后才能與抗體結合而被檢測到，例如核內抗原PCNA和Ki67。

此外，固定時間不能太長，否則容易導致交聯(lián)反應而影響熒光素的化學特性或增加自發(fā)熒光。

12、貼壁細胞和受體

如果你在檢測貼壁細胞，使用的是胰酶消化，那么需要注意胰酶可能會影響一些表面標記的表達。類似的現(xiàn)象也會發(fā)生在膠原酶消化后。

13、噪音和背景信號

PMT的背景信號和噪音高也會導致信號弱，這可能是由于激光源的散射光、其它熒光素的滲漏或自發(fā)熒光過強等原因引起。

14、熒光滲漏

熒光滲漏是多色流式時檢測信號出問題最常見的問題所在。所以，正確的補償非常重要。

關于補償，請參見帖子：

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3523-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2191-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-20-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-396-1-1.html

背景熒光強/非特異性染色明顯

背景熒光高（即非特異性染色明顯）可能是多種因素造成，例如熒光素、抗體、標記方法、儀器、其它試劑或數(shù)據(jù)分析等。在此，我們對這些因素進行一一解析，讓大家能夠充分了解背景熒光的來源，從而能夠在實驗中針對性的去解決。

1、自發(fā)熒光

不同細胞和組織，以及培養(yǎng)基添加物，都有不同水平的自發(fā)熒光。自發(fā)熒光主要的來源包括NADH、核黃素、黃素輔酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交聯(lián)、某種生物結構（如線粒體、溶酶體等）。粒系細胞特別容易出現(xiàn)自發(fā)熒光，因為這些細胞內的蛋白和分子更容易在低波長時被激發(fā)（例如紫外、紫光和藍光），發(fā)射波長大約在500~700nm，與一些常見的熒光素（如FITC、PE）重疊。所以對這類細胞應該記得用未染色的空白對照檢查一下自發(fā)熒光水平。

另外切記，直方圖上看不出自發(fā)熒光群，只有通過散點圖才能看出自發(fā)熒光群體并將它圈出，如下圖中所示FL-1（GFP）和FL-2散點圖查看GFP表達細胞，直方圖看到兩個峰，但無法區(qū)分自發(fā)熒光，而散點圖則可輕松圈出自發(fā)熒光群體（AF）。

2、稀釋

抗體用量是否合適？盡管廠家會有推薦的抗體用量，但要記得使用前進行抗體滴定，以了解最佳用量。優(yōu)化后的抗體用量可以幫助你最大程度地減少背景熒光并提高信噪比。

3、補償高

如果兩個或更多的熒光素之間發(fā)射譜重疊，那么就需要調節(jié)補償以消除相互間的影響。不過，調節(jié)補償前，首先需要電壓值調節(jié)到合適的值，否則會導致補償異常增大。例如下圖中，BV510?和BV570?之間由于相互滲漏存在補償，如果BV570?的電壓被BV510?的電壓明顯高，那么會導致補償過大（下圖左側），如果PMT電壓調節(jié)到合適值，那么他們的補償就非常好調了（下圖右側）。

所以，有時候你的背景熒光高很可能是由于電壓沒有調好的問題。

4、代謝活化

背景熒光增高也可能由于代謝活化引起。例如在PMA活化的PBMC中染IL-17A時，從FMO對照中明顯看出BV421?通道基線的上升，這可能由多個因素引起，包括自發(fā)熒光增高和其它熒光素的滲漏增大引起。

5、花青素染料

花青素染料和一些相關串聯(lián)染料很容易結合到Fc受體，尤其是單核細胞。這種反應無法通過Fc受體阻斷劑阻斷，其確切原因未知。如果你在研究髓系細胞中的一個群體，建議還是用其它類別的熒光素。

6、細胞碎片

你有沒有用活性染料來確保分析時都能分析到活細胞？細胞碎片、死細胞可導致高背景染色，所以在設門時，切記要排除掉碎片。一般情況下，碎片在FSC/SSC散點圖中位于最左下方（如下圖）。

7、活性

如果分析時不小心設門將死細胞/碎片圈進了，就可能會出現(xiàn)一些假陽性。所以用PI或7-AAD甚至一些更好的活性染料，能夠很好的排除死細胞（關于活性染料，我們之前發(fā)過一篇相關文章：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4124-1-1.html）。

DAPI也可以用來區(qū)分死/活細胞，它也能夠透過活細胞膜，但效率很低。下圖顯示了DAPI+細胞群和DAPI-細胞群之間CD45/CD11b散點圖的區(qū)別。

8、Fc阻斷

Fc受體表達在很多細胞表面，包括粒細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。它們很容易結合抗體的Fc部分，從而導致結果假陽性。為了這種背景熒光，推薦使用商品化的Fc受體阻斷劑或相應物種的血清。

9、FMO/同型對照

同型對照是為了幫助確定目的抗體非特異性背景染色（針對Fc受體或胞內蛋白結合）而設置的陰性對照。FMO（熒光扣從對照）相對來說在抗原表達弱、或者進行多色流式實驗的時候更適合，它可以反映你的抗體組合中其它通道熒光的滲漏，幫助你選擇正確的陽性群體。

如果你要使用同型對照，記得一定要選擇與目的抗體相同量的同型抗體。例如你使用1ug CD4，那么就要使用1ug同型對照。

避免從不同公司購買同型和目的抗體，因為不同的公司，其抗體熒光素：蛋白（F：P）比例是不同的。

10、粘連體

粘連體通常發(fā)生在細胞之間粘附在一起或分裂過程中。粘連體給流式細胞術分析帶來了困難，因為粘連體通過檢測點時，檢測裝置仍然認為它是一個信號。所以如果沒有在分析時設門排除掉粘連體，那么就可能對結果造成誤讀。

在流式緩沖液中加入EDTA，并且將標本通過30um過濾，可以使粘連體大大減少。

粘連體還可以通過散點圖的W/H或W/A設門排除。如下圖，（1）代表單個細胞群，（2）代表粘連體，兩種群體的結果明顯不同。

11、串聯(lián)染料降解

如果你使用的是串聯(lián)染料，那么如果抗體保存不當或者沒有避光，那么就可能發(fā)生降解。在下圖的例子中，左圖是正常的PE-cy5檢測結果，可以看到FL2沒有信號，但PE-cy5染料在光照后降解，右側圖就可以明顯看到FL2（PE通道）也能檢測到很強的信號。

串聯(lián)染料對某些固定方式也很敏感，所以如果在固定后檢測發(fā)現(xiàn)背景熒光異常，那時也需要考慮是否由于固定劑引起。