CAR T細胞療取得了巨大的成功。但它的不良事件，例如細胞因子釋放綜合征（CRS），神經毒性，移植物排斥，靶上非腫瘤毒性和腫瘤復發(fā)，已經束縛了CAR-T細胞療法的搶救之手。此外，在實體瘤治療的情況下，CAR T細胞療法未產生令人鼓舞的結果，這主要是由于諸如以抑制方式起作用導致CAR-T細胞功能障礙的強大的腫瘤微環(huán)境（TME）網絡之類的挑戰(zhàn)。

在本文中，我們傾向于對上述注意事項進行詳細描述，然后討論旨在消除這些注意事項的明智策略。此外，我們簡要介紹了這種精心設計的策略如何使更安全，更有效的CAR T細胞療法成為可能。

一、對抗CRS和神經毒性藥物

CRS是CAR T細胞療法最常見的副作用，通常在過繼轉移后幾天觀察到（28，33）。CRS通常的特征是IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，干擾素-γ（INF-γ），粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），和患者血清中的腫瘤壞死因子α（TNF-α）（28，33）。所謂風暴的起點是CAR T細胞與靶抗原結合后的活化（28、33）。這種激活導致CAR T細胞產生和分泌炎性細胞因子（28、33）。響應這些細胞因子，其他先天免疫細胞，例如巨噬細胞，開始釋放炎性細胞因子，例如IL-1和IL-6，從而形成炎癥環(huán)（28、33）。為了使情況得到控制，需要中斷所提到的自我強化循環(huán)。

研究人員報告說，患者的腦脊液中存在CD19重定向的CAR T細胞，同時促炎性細胞因子水平升高（28，34）。此外，高濃度的這種細胞因子可能激活腦血管內皮和血腦屏障（BBB），導致它們的通透性和隨之而來的腦水腫（35）。根據Parker及其同事的最新報告，在基于CD19的CAR T細胞療法的情況下，觀察到的神經毒性可歸因于CAR T細胞對表達CD19的腦壁細胞的靶向作用（36）。

在本節(jié)中，我們簡要討論了可能有益于CAR T細胞介導的CRS和神經毒性治療的策略。

GM-CSF封鎖

GM-CSF是激活巨噬細胞和單核細胞的細胞因子，已知是介導CRS的重要因素（28、29）。GM-CSF可以使用mAb（例如lenzilumab）中和，這可以導致中樞神經系統(tǒng)（CNS）中髓樣和T細胞浸潤的明顯減少（37）。這種減少有助于緩解臨床前模型中的神經炎癥（NI）和預防CAR T細胞介導的CRS（37）。此外，這種方法不僅不會干擾CAR T細胞的功能，而且還可以通過降低CAR T細胞介導的CRS和NI的風險來提高其殺傷效果（37）。

詳細地說，GM-CSF中和作用可抑制引起CRS的細胞因子（如IL-6）的分泌，并減少其他CRS介導的促炎因子（包括IL-8和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1））的產生。作為免疫細胞運輸介體（38，39）。

這種方法在臨床前模型中降低了關鍵CRS介體的水平并增強了CAR T細胞的抗腫瘤活性（37）。最重要的是，還可以對CAR T細胞進行基因工程改造，以分泌GM-CSF中和抗體，從而進一步減輕CRS和神經毒性的風險。

IL-1和IL-6封鎖

研究表明，單核細胞和巨噬細胞釋放的IL-1和IL-6與CAR T細胞介導的CRS和免疫效應細胞相關的神經毒性綜合癥（ICANS）相關（41，42）。臨床前數(shù)據表明，在CRS發(fā)生期間，單核細胞是IL-1和IL-6的主要來源（42）。已經證明，可以通過使用tocilizumab的單核細胞消融或IL-6受體阻斷等方法預防CRS（42）。但是，據報道tocilizumab不能預防臨床前小鼠模型中的延遲致死性神經毒性（42）。在這種情況下，Anakinra是一種免疫抑制藥物和IL-1受體拮抗劑，在臨床前小鼠CRS模型中給藥后，通過保護它們免受致死性神經毒性和CRS的侵害，已顯示出令人鼓舞的結果（42）。

總之，IL-1和IL-6都是CAR T細胞輸注后CRS和神經毒性發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素（42）。

兒茶酚胺封鎖

最近，已發(fā)現(xiàn)高水平的循環(huán)兒茶酚胺可通過巨噬細胞中的自增強環(huán)介導各種類型的免疫失調，包括CRS（45）。兒茶酚胺在由T細胞活化治療劑誘導的細胞因子釋放中具有有效作用（45）。已經發(fā)現(xiàn)抑制兒茶酚胺的合成可以導致體內和體外細胞因子釋放水平的顯著降低（45）。此類研究表明，兒茶酚胺是細胞因子釋放的關鍵調節(jié)劑，不僅阻斷其合成途徑不會導致副作用或CAR T細胞功能受損，而且還可以降低CRS發(fā)生和發(fā)展的發(fā)生率（45、46）。

二、抵抗免疫排斥（此部分是針對異體CART的）

同種異體T細胞（從健康供體獲得）可能會被受體的免疫系統(tǒng)排斥（28、29）。這種不利事件主要由受體的T細胞和自然殺傷（NK）細胞介導，因為這些細胞將同種異體CAR T細胞識別為入侵的外來細胞，應從宿主體內清除掉（47-51）。

同種免疫防御受體（ADR）

解決同種異體CAR T細胞排斥問題的最新策略之一是利用受體T細胞和NK細胞上存在的4-1BB細胞表面受體（51）。該受體的表達在活化的T細胞和NK細胞中被上調（51）。此策略使用一種名為Alloimmune Defence Receptor（ADR）的工程受體，該受體由4-1BB配體（4-1BBL）衍生的4-1BB識別域，細胞內CD3ζ域，間隔區(qū)和跨膜結構域（ 51）。ADR被設計為在CAR T細胞的表面表達（51）。具體而言，ADR識別活化的同種異體反應性T細胞和NK細胞表面上調的4-1BB分子，這導致表達ADR的CAR T細胞被激活，并消除受體的同種異體反應性免疫細胞（51）。而且，ADR的表達不會影響CART細胞的效應子功能，因此，這種方法可以為異體CAR T細胞提供一種新武器，它們可以用來抵抗免疫細胞以試圖干擾它們對抗腫瘤的作用（51）。

圖2表示表達ADR的CAR T細胞的詳細描述。

CD47表達

CD47是一種跨膜蛋白，負責介導多種類型的惡性細胞中的“不要吃我”信號（55）。信號調節(jié)蛋白-α（SIRPα）被認為是包括巨噬細胞在內的各種免疫細胞上CD47的受體（55）。一旦在其表面表達CD47抗原的腫瘤細胞遇到巨噬細胞，CD47就會與SIRPα結合，從而導致“不吃我”信號的傳播，并因此消除巨噬細胞的吞噬作用（55）。因此，使用這種機制，惡性細胞可以輕松逃避免疫系統(tǒng)介導的根除（55）。當使用同種異體CAR T細胞避免巨噬細胞輔助的CAR T細胞排斥和隨后的清除時，可以應用該機制。在這方面，可以改造CAR T細胞使其表面表達CD47，以逃避巨噬細胞的吞噬作用。

敲除TCR和HLA

研究人員還利用基因工程方法來降低使用同種異體CAR T細胞時的同種異體反應水平。在這方面，TRAC基因是最重要的靶標之一，已通過多種遺傳操作策略（例如TALEN，鋅指核酸酶（ZFN）和CRISPR-Cas9）敲除基因，可有效消除這兩種基因TCRα和β鏈和減輕同種反應性（56-60）。此外，其他研究人員強調了使用具有TCR和CD52基因敲除功能的同種CART細胞，并證明這些細胞可作為令人滿意的通用CAR T細胞候選物，因為它們不會引起同種異體反應并能夠介導患者的分子緩解使用R/R B ALL（57）。值得一提的是，CD52的敲除使這些CAR T細胞對抗CD52抗體alemtuzumab的耗竭作用具有抵抗力（57）。此外，其他研究人員還研究了TRAC基因位點中CRISPR-Cas9介導的CAR轉基因敲入，因為他們認為該方法也可以與其他提及的破壞同種異體CART細胞中內源TCR表達的方法一樣有效（61）。同樣，CRISPR-Cas9和ZFN都已被用于消融HLA表達，以減少使用同種異體CAR T細胞時的同種異體反應水平（62，63）。

三、克服目標外腫瘤毒性的策略

即使在較低的比率下，CAR T細胞靶向的TAA也通常在健康組織中表達。然而，盡管靶抗原表達受到限制，CAR T細胞仍設法識別這些正常細胞并引發(fā)針對它們的細胞溶解反應。這種現(xiàn)象導致消除了那些健康細胞（稱為“靶外非腫瘤”毒性），從而導致威脅生命的副作用，例如對各個患者造成多器官衰竭。為了解決這些局限性，科學家設計了具有腫瘤選擇性機制的智能CAR構建體，能夠精確地區(qū)分惡性和健康細胞。在本節(jié)中，我們將簡要討論其中一些策略，同時重點介紹它們的優(yōu)缺點。

“隱蔽”CAR

有條件的活性CAR構建體（其抗原識別域由前體組成）構成了“隱蔽CAR”的新策略，從而增加了CAR T細胞在治療缺乏確定性TAA的癌癥中的適用性（73）。具體而言，前體抗體是一種抗體，其抗原識別位點被被蛋白酶敏感的接頭重組連接的掩蔽肽所覆蓋，該蛋白酶敏感的接頭僅對TME蛋白酶易發(fā)生蛋白水解切割（73、74）。該蛋白酶敏感的接頭僅對TME蛋白酶易發(fā)生蛋白水解切割（73、74）。從概念上講，在腫瘤相關蛋白酶的存在下會切割蛋白酶敏感的連接子，從而導致隨后的掩蔽肽脫離并暴露出靶向結構域的抗原結合位點（73）。

這種情況為效應細胞的下游殺腫瘤反應打開了大門（圖3A）（73）。與常規(guī)mAb相比，由于其延長的藥代動力學半衰期，因此其安全性指數(shù)已大大提高，這使得它們在達到與常規(guī)mAb相同的劑量水平時，可以達到更高的暴露率（74）。這種擴展的安全區(qū)在隱蔽的CART細胞療法領域可能是可翻譯的，其方式是更高的輸注劑量可以施加更有效的治療效果，而不會越過安全紅線（73）。

抑制性CAR（iCAR）

最小化“目標外腫瘤毒性”的有害損害或旁觀者健康組織損害的另一種策略是使用抗原特異性iCAR。一般概念是使表面抗原識別域與內源性免疫抑制受體（例如CTLA-4或PD-1）的信號域融合，從而可逆地限制T細胞細胞因子的分泌，細胞毒性和增殖，盡管激活受體同時參與（可以是CAR，也可以只是工程TCR）（75）。iCAR平臺允許T細胞以抗原選擇性方式區(qū)分健康細胞和癌細胞（圖3B）（75）。在沒有其特異性抑制抗原的情況下，iCAR構建體的轉基因表達不會影響T細胞的基本功能（75）。此外，其他T細胞限制性抑制受體，例如BTLA，2B4和LAG-3或它們在單個第二代iCAR中的組合或作為具有多個組合胞質結構域的iCAR，也可以用于調節(jié)CAR T的細胞毒性功能細胞（75-77）。

盡管實驗證明iCART細胞即使暴露于抑制性抗原后仍能維持其殺腫瘤功能，但仍不能完全排除一部分iCAR T細胞因反復暴露于抑制性抗原而變質的可能性（75、78）。而且，由于這種精心設計的調節(jié)方法是抗原特異性的，因此需要由健康組織表達但腫瘤細胞不存在或受其下調的組織特異性靶抗原（75）。人白細胞抗原（HLA）可能是具有此類特征的合適抗原，因為它在所有細胞類型中都有表達，但基本上被腫瘤細胞下調，賦予它們逃避T細胞介導的免疫系統(tǒng)反應的能力（79）。

邏輯門CART細胞

已經開發(fā)出一種跨信號CAR策略，其中T細胞激活信號和共刺激信號在兩種抗原特異性不同的CAR中彼此物理解離，從而為CART細胞配備了“雙重或無”策略（80–84）。從概念上講，對T細胞進行了基因修飾以表達兩個CAR。一個僅包含CD3ζ信號域并識別具有低親和力的目標抗原和嵌合共刺激受體（CCR）的受體，其可識別具有高親和力的另一目標抗原（80-84）。此外，CCR與抗原的結合提供了T細胞活化和有效細胞毒性所必需的共刺激信號級聯(lián)反應（80-84）。表達這兩種構建體的基因改造T細胞在遇到正常細胞時不會被有效激活，由于激活信號不足，它們僅表達兩種抗原之一（圖3C）（80-84）。

但是，有幾個問題對該提議的策略的實用性提出了質疑。局限性，例如鑒定僅在給定類型的癌癥中表達的兩種腫瘤抗原，在正常組織中不重疊表達（81）。另外，另一個限制涉及設計具有較窄的最佳親和力范圍的CAR或實際上適用于幾乎廣泛范圍的患者的CAR的困難（80）。

體外研究結果表明，通過對僅表達一種TAA的細胞進行反信號的CAR T細胞信號轉導，細胞因子分泌較弱，并且在遇到共同表達兩種抗原的腫瘤細胞時，其細胞因子的分泌也很明顯（81）。這些發(fā)現(xiàn)表明，雙特異性反信號CAR平臺可以增強CAR T細胞對靶癌細胞的治療效果，同時降低它們與正常組織的交叉反應性（81）。

僅有共刺激CAR的γδT細胞

最近，研究人員使用了γδT細胞，它是T細胞的一個子集，其中的TCR具有γδ亞基，而不是更常見的αβ亞基（85，86）。γδT細胞約占循環(huán)T細胞的1-10％，但它們是免疫系統(tǒng)的重要組成部分（87）。Vγ9Vδ2T細胞是γδT細胞的一個子集，具有內在的腫瘤區(qū)分能力，因為它們可以識別非肽類腫瘤抗原的磷酸抗原，并且是代謝失調的腫瘤細胞的典型特征（88）。研究人員研究了一種以Vγ9Vδ2T細胞為骨架以生成獨特的“共刺激僅域CAR”的新策略（89）。與傳統(tǒng)的αβT細胞（用作生產CAR T細胞的主要來源）不同，γδT細胞可識別其靶抗原，而不依賴于MHC I類或II類（90）。Vγ9Vδ2TCR是由γδT細胞表達的最普遍的γδTCR（90）。這些TCR識別在癌細胞中而不是在健康細胞中過量產生的磷酸抗原，例如異戊烯基焦磷酸酯（IPP）（90）。γδT細胞通過將這些抗原識別為“危險警報”來區(qū)分癌細胞和正常細胞（90）。研究表明，從T細胞與Vγ9Vδ2TCR產生的靶向GD2的僅共同刺激的CAR T細胞是功能性的，并且僅在體外顯示出針對GD2陽性神經母細胞瘤細胞的強大溶細胞反應，而對GD2陽性正常細胞則沒有（見89）。這一事實突出了內源性Vγ9Vδ2TCR的作用，因為CD3ζ信號僅由與內源性Vγ9Vδ2TCR相互作用的腫瘤細胞提供（圖4A）（89）。

此外，其他研究也提出了類似的有希望的結果，表明使用Vδ2T細胞生成的CAR T細胞（稱為γδCART細胞）可以向腫瘤細胞遷移并進行抗原交叉呈遞（91）。這些發(fā)現(xiàn)表明，γδCAR T細胞可以進入腫瘤部位并消除腫瘤細胞，同時攝取靶抗原，從而導致刺激性抗原通過αβTCR呈遞至腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）（91）。已經提出，諸如黑色素瘤之類的腫瘤可能是這些戰(zhàn)斗細胞的正確戰(zhàn)場，因為它們具有高的腫瘤抗原頻率以及大量的腫瘤反應性淋巴細胞和TIL（91）。這個事實可以認為是γδCART細胞優(yōu)于常規(guī)CAR T細胞的優(yōu)勢，這在實體瘤的治療中可能是非常值得的（91）。

簡而言之，仍然可以得出結論，γδTCAR T細胞可能顯示出對實體瘤的前瞻性臨床評估的希望，因為它們比常規(guī)CAR T細胞具有獨特的有用特性。

通用CAR（UniCAR）

減少腫瘤外副作用風險的另一種精心設計的策略是使用被稱為UniCAR的模塊化CAR平臺。這種策略使得在不良的CAR T細胞介導的副作用發(fā)生的情況下，盡可能快地可逆地關閉CAR系統(tǒng)成為可能（93）。從概念上講，UniCAR由UniCAR效應T細胞和經過工程改造的重組靶模塊組成，這些模塊將它們引導至適當靶細胞的表面（圖4B）（93）。靶模塊的特異性決定了UniCART細胞確切地應該攻擊哪個靶細胞，并且從循環(huán)中快速清除它們的安全性指標足以證明其將UniCAR T細胞切換為“開”和“關”（93）。由于UniCAR T細胞的抗體結構域針對靶標模塊上的獨特表位，因此它們可以在存在時建立免疫復合物（93）。這將引導UniCAR T細胞向其靶細胞（93）轉移。另一方面，在沒有目標模塊的情況下，UniCAR T細胞會自動關閉，這使得它們的控制比常規(guī)CAR T細胞更為可行（93-95）。為了在UniCAR T細胞治療期間最大程度地降低CRS的風險，應從低劑量開始快速清除靶模塊，然后根據意外副作用的出現(xiàn)對其進行調整和增加（93）。一旦消除了所需的靶細胞或發(fā)生了任何危及生命的不良事件，靶向模塊給藥的終止將僅導致UniCART細胞被關閉（93）。

四、克服輸液后控制限制的策略

迄今為止，已經進行了各種嘗試以在將CAR T細胞注入患者體內后控制其活性。這個話題值得特別關注，因為它可以有助于控制和預防先前提到的CAR T細胞介導的毒性，有時可能會危及生命。在本節(jié)中，我們簡要概述了旨在控制工程改造T細胞表面上CAR表達的策略，以及為在給藥后全面控制CAR T細胞而開發(fā)的一些最有效的策略。

淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（LCK）抑制

已經證明酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼是FDA批準的費城染色體陽性慢性髓細胞性白血?。–ML）和ALL的治療藥物，它抑制LCK，從而阻止CD3ζ和ZAP70的磷酸化（96）。Mestermann及其同事已經開發(fā)出dasatinib來提高CAR T細胞的安全性指數(shù)（96）。所提及的機制可以介導具有CD28-CD3ζ或4-1BB-CD3ζ激活模塊的CAR中下游信號級聯(lián)的破壞（96）。此外，達沙替尼可以誘導CD8和CD4陽性CAR T細胞快速發(fā)生（3小時）冬眠，這種現(xiàn)象可以持續(xù)數(shù)天而不會對T細胞的生存能力產生任何負面影響（96）。此外，達沙替尼的不同給藥方案可用于部分或完全抑制CAR T細胞活性（96）。研究表明，在臨床前CRS小鼠模型中，CAR T細胞輸注后不久，給予dasatinib可以使其免受CRS的侵害，否則CRS可能在不接受dasatinib的模型中致死（96）。該方法的主要優(yōu)點是，在中斷達沙替尼給藥后，其抑制作用迅速而完全逆轉，因此，先前受影響的CAR T細胞可以繼續(xù)其正常的信號傳導途徑和抗腫瘤活性（96）。達沙替尼的良好藥效學是該方法的另一個優(yōu)勢，它允許多次使用該藥物以使“關”和“開”的連續(xù)CAR T細胞活性得以利用?？傊?，在接受CAR T細胞的臨床前模型和體外測定中達沙替尼的給藥可中止CAR T細胞的溶細胞活性，細胞因子生成和擴增，并且可以用作CAR T細胞的藥理開/關開關（96）。

STOP CAR

STOP CAR是最近開發(fā)的CAR平臺，由負責抗原結合的識別（R）鏈和負責T細胞活化的信號（S）鏈組成（98）。這兩條不同鏈的內結構域具有一個經過計算設計的蛋白質對，可幫助它們二聚為功能性異二聚體，而無需二聚劑（98）。這種異二聚體是一種化學可破壞的異二聚體（CDH），可以通過施用小分子，例如A1331852和A1155463（它們是Bcl-XL抑制劑）將其專門破壞并分解成兩個單體（98）。具有有效臨床應用，延長的半衰期和對人類具有顯著耐受性的破壞性小分子的可用性是此類CDH設計的原則（98）。STOP CAR平臺的基本目的是利用來自模塊化蛋白的球形結構域，該結構域不會干擾突觸附近的T細胞信號傳導（98）。

SWIFF CAR

可以通過調節(jié)T細胞表面CAR分子表達的機制來控制CAR T細胞的活性（作為開關）。最近，Juillerat等人。已經產生了一個稱為T-OFF CARs（SWIFF-CARs）的CAR T細胞活性控制平臺，該平臺需要使用基于蛋白酶的小分子輔助封閉（SMASh）（102）。在該平臺上，SWIFF-CAR構建體由CAR分子，隨后的蛋白酶切割位點，蛋白酶（HCV NS3蛋白酶）和稱為“ degron”的降解部分組成（102）。在沒有細胞滲透性蛋白酶抑制劑Asunaprevir的情況下，蛋白酶會切割其靶位點，導致CAR從蛋白酶和degron上解離（102）。這種變化將導致CAR分子移位到細胞表面，使其具有正?；钚圆l(fā)出級聯(lián)信號（稱為“ ON”的狀態(tài)）（102）。另一方面，在存在Asunaprevir的情況下，它會與蛋白酶上的結合位點結合并抑制其裂解活性（102）。因此，CAR分子不會從蛋白酶切割位點，蛋白酶和地格隆解離，這將導致CAR分子的蛋白水解降解（稱為“ OFF”的狀態(tài)）（圖5B）（102）。這項研究表明，將一個開關直接整合到CAR結構中是可行的，這可以實現(xiàn)CAR表面表達的可逆控制（102）。

五、自殺策略

過去幾年中，選擇性和永久性消融CAR T細胞（包括發(fā)生GVHD或靶上非腫瘤毒性）一直是眾多研究的主題。人們已經認識到在上述不良事件期間需要能夠不可逆地消除CAR T細胞的安全開關以及這種策略的實施是解決這些挑戰(zhàn)的有效方法。這些安全開關之一是基于自殺基因技術的，該自殺基因技術通過不同的機制起作用，例如代謝途徑，試劑二聚化以及通過治療性mAb靶向。在接下來的部分中將詳細討論這些開關。值得一提的是，生物休眠以及良好的生物利用度和生物分布特征都是理想的自殺開關活化劑（103）的理想特性。

代謝開關

自殺開關可以基于將無毒的化合物轉化為有毒的化合物，最終起到殺死自殺開關的細胞的作用。與哺乳動物細胞胸苷激酶不同，單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）對更昔洛韋（GCV）的親和力極高，后者是一種核苷類似物（104，105）。HSV-TK將GCV磷酸化為GCV-單磷酸酯（MP），最終將其轉化為GCV-三磷酸酯（TP）。DNA聚合酶將GCV-TP整合到DNA的前導鏈中，從而導致GCV誘導的鏈終止（106，107）。

HSV-TK/GCV自殺開關還能夠通過與Fas相關的死亡域蛋白（FADD）的形成和通過與配體無關的CD95聚集激活胱天蛋白酶來觸發(fā)誘導死亡的信號級聯(lián)反應（108）。盡管HSV-TK開關具有漸進的有效性和潛在的免疫原性風險（由于其病毒來源），但其受益風險比在臨床上仍可能是有利的（圖6A）（104、105）。

此類自殺誘導開關的另一個示例涉及胞嘧啶脫氨酶（CD），它是一種嘧啶挽救酶（109）。從機制上講，5-氟尿嘧啶（5-FU）是抗真菌藥物5-氟胞嘧啶（5-FC）通過CD脫氨基的產物，因此它起著能夠誘導細胞死亡的高度細胞毒性化合物的作用（109） 。在這方面，給CAR T細胞裝備編碼諸如HSV-TK或CD的酶的基因能夠在遇到不利并發(fā)癥時不可逆地消除輸注的CAR T細胞。此外，1型HSV-TK基因也被稱為正電子發(fā)射斷層掃描（PET）報告基因，可利用該基因提供有關CAR T細胞向腫瘤部位轉運的見解（110）。

基于mAb的開關

選擇性體內消融CART細胞的另一種自殺轉換策略是其基因工程，以協(xié)調表達CAR和重組細胞表面蛋白（111-113）。該重組蛋白應保留由給定的藥物級單克隆抗體識別的構象上完整的結合表位，例如西妥昔單抗（EGFR特異性mAb）或利妥昔單抗（CD20特異性mAb）（111–113）。這種方法使上述CAR T細胞在暴露于該試劑時易受抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）的影響，而不會改變其細胞毒性功能（圖6B）（111-113）。

還令人鼓舞的是，在臨床前小鼠模型中，沒有針對EGFRt陽性CAR T細胞的EGFRt分子（表皮生長因子受體的截短形式）表現(xiàn)出免疫原性的跡象（113）。這些發(fā)現(xiàn)支持以下假設：西妥昔單抗的給藥可能會導致接受基于CD19的CAR T細胞治療并經歷CD19重定向的CART細胞長期持續(xù)存在，B細胞發(fā)育不良和完全變性的患者的B細胞區(qū)室恢復腫瘤消退（113）。但是，由于基于mAb的開關可能會嚴重損害表達天然形式重組蛋白的健康組織，因此仍存在一些基于mAb的開關在臨床上應用的擔憂（103）。

iCasp

誘導型安全開關的另一個例子是基于修飾的FKBP12（人FK506結合蛋白）與人半胱天冬酶9或Fas的膜錨定細胞內結構域的重組融合（117、118）。這種方法可以在存在生物惰性二聚劑（例如AP1903）的情況下隨意進行二聚（117、118）。從概念上講，修飾的FKBP12以高親和力與合成的二聚藥物結合，從而可誘導caspase 9（iCasp9）或基于Fas的自殺開關（117、118）進行二聚化和隨后的活化。這導致胱天蛋白酶級聯(lián)反應，導致表達這些構建體的細胞凋亡（圖6C）（117、118）。此外，研究報告稱，在GVHD患者單劑量給予二聚化藥物后的30分鐘內，消除了配備iCasp9的T細胞> 90％（118）。此外，這種快速消除與無復發(fā)的GVHD的分辨率相關（118）。此外，與其他安全開關相比，iCasp9開關具有一些優(yōu)勢，例如其低免疫原性（由于iCasp9自殺基因的人類起源）以及利用生物學惰性的小分子對其進行激活（而不是抗病毒）更昔洛韋等藥物（118）。這些優(yōu)點使此安全開關成為在細胞治療領域中更合適的選擇。而且，通過在細胞中內源性凋亡途徑的參與（在施用二聚化藥物后的數(shù)分鐘內），這種開關的快速細胞死亡介導比其他需要干擾DNA合成以誘導細胞死亡的安全開關快得多 119–124）。

六、克服腫瘤復發(fā)的策略

由于單個腫瘤內以及不同患者之間的抗原異質性，沒有一種抗原可以被認為是通用的?？乖瓉G失，抗原下調或交替剪接的抗原的出現(xiàn)（由于已識別的表位的喪失而不再被CAR T細胞靶向）都是腫瘤細胞為逃避免疫識別而執(zhí)行的精心設計的抗原依賴性策略（125–127）。因此，這種現(xiàn)象限制了靶向免疫治療的腫瘤療效，導致不良的臨床反應（125-127）。同時多特異性靶向是旨在抵消可能提供增強的免疫療法介導的緩解的持久性的腫瘤抗原逃逸變體的提議策略之一。與常規(guī)CAR T細胞相比，其CAR構建體以串聯(lián)方式配備雙特異性靶向結構域的CAR T細胞（Tandem CAR或TanCAR）或共表達對兩種不同TAA特異性的兩種不同嵌合受體的T細胞可能具有優(yōu)勢。這些基因操縱的T細胞具有細胞毒性靶向同時表達一種或兩種抗原的腫瘤細胞的能力。此類CAR T細胞在體外和成膠質母細胞瘤和B細胞惡性腫瘤等人類腫瘤的動物模型中均表現(xiàn)出增強的抗腫瘤活性（128-134）。

根據一項來自臨床試驗（NCT03185494）的最新報告，該試驗評估了雙特異性CD19/CD22重定向的CAR T細胞在成人R/R B-ALL患者中的殺傷效果，所有6名患者（100％）均患有MRD陰性CR沒有神經毒性的發(fā)作（135）。

此外，在疾病復發(fā)的情況下，UniCAR T細胞也可能是有益的，因為在引入靶向新腫瘤抗原的靶向模塊（而不是剪接的或表達缺失或表達缺失的靶向模塊）后，UniCAR T細胞可引發(fā)針對逃避腫瘤細胞的細胞毒性反應下調）（93）。這種能力證明了為什么該CAR平臺可普遍適用于不同的目標靶抗原，而無需重新設計新的CAR構建體。

七、克服免疫抑制

TME的策略

缺氧的TME性質可以利用正常組織和癌性組織本質上的主要差異來開發(fā)智能的TME響應或躲避性治療方法。營養(yǎng)性水平低，細胞外pH值低（酸中毒）和氧合水平低（缺氧）是TME特有的各種特征（136、137）。低氧微環(huán)境的特征是氧合水平通常低于1-2％（136，137）。此外，免疫抑制性缺氧-A2-腺苷能軸是許多耐治療性腫瘤的一個非常有趣的特征（138）。發(fā)現(xiàn)上游因子在該途徑中的關鍵作用導致了抑制缺氧/低氧誘導因子-1α（HIF-1α）軸的獨特對策的發(fā)展（139，140）。針對A2A腺苷受體（A2AR）和產生腺苷的外切酶CD73的臨床前研究已經產生了顯著的治療效果（139-142）。

結論是，TME的低氧特性介導了T細胞和CAR T細胞中無反應性和疲憊水平的升高以及細胞因子產生和分泌水平的降低（143）。研究人員表明，補充氧合和利用氧合劑可以逆轉TME中的缺氧（143-145）。他們認為這種方法可以避免HIF-1α的穩(wěn)定并損害缺氧腺苷能免疫抑制軸（143-145）。他們證明了這種方法可以將TME的性質從“免疫抑制”重新編程為“免疫容許”（143-145）。此外，他們還強調了全身性氧合和氧合劑與A2AR阻滯劑結合使用的臨床應用，以進一步解決TME的免疫抑制性質（143）。該策略可破壞免疫抑制性缺氧-腺苷能信號轉導軸的上游和下游（分別為低氧-HIF-1α和腺苷-A2AR）級聯(lián)反應，并可以在最大程度提高A2AR拮抗劑的治療效果的同時提高腫瘤對癌癥治療的敏感性（圖7）（143）。

此外，其他研究人員也利用了TME的缺氧，并設計了智能的自我決策制造CAR T細胞（146）。他們將HIF-1α的一個對氧敏感的亞結構域融合到了一個CAR支架上，并產生了對缺氧環(huán)境有反應的CAR T細胞（146）。已經開發(fā)出這種策略以將CAR的表達限制為僅存在于低氧TME中的那些CAR T細胞（而不是非惡性組織的非低氧環(huán)境中的CAR T細胞）（146）。因此，這些CART細胞可以減少常規(guī)CAR T細胞的離腫瘤效應（146）。

CAR T細胞的代謝重編程

T細胞的細胞代謝條件對T細胞的效應子功能和分化狀態(tài)有很大影響（147）。而且，在轉導的T細胞中表達的CARs的成分會影響其營養(yǎng)攝入和代謝狀態(tài)（147）。在T細胞中發(fā)現(xiàn)的代謝功能關系可以用作定義其命運，活性和效應子功能的工具（147）。例如，研究表明，CARs結構中4-1BB共刺激結構域的存在使T細胞產生了中樞記憶表型，并增強了脂肪酸的氧化分解能力，同時改善了其擴張能力和持久性（147）。另一方面，CD28共刺激結構域改善了糖酵解，并使CAR T細胞發(fā)展了效應記憶表型（147）。此外，補充如補充L-精氨酸可以平衡活化T細胞中精氨酸代謝的提高，同時改善殺腫瘤功能并誘導中樞記憶表型的發(fā)展（148）。

詳細了解主要參與細胞代謝的基因的基因表達譜，可以通過改變代謝基因的表達水平來幫助我們實現(xiàn)T細胞代謝重編程的目標。擬議的策略是過表達Akt途徑或Glut1轉運蛋白，以解決由白血病細胞引起的這一警告（149）。這種策略可以使T細胞的功能恢復到腫瘤細胞對其施加負面影響之前的水平（149）。此外，PPAR-γ共激活因子1a，也稱為PGC1a，是影響多種細胞代謝途徑的轉錄因子共激活因子。該新陳代謝調節(jié)劑在浸潤腫瘤部位的T細胞中被下調（150）。研究人員發(fā)現(xiàn)，T細胞中PGC1a的過度表達可重建其效應子功能以及其代謝和線粒體活性（150）。

此外，研究已經利用腫瘤細胞和組織的特性和行為來重新編程T細胞的代謝（152、153）。在這方面，已經發(fā)現(xiàn)壞死的腫瘤細胞在TME中釋放鉀（K+），這導致該離子的過度積累（152）。這種現(xiàn)象使腫瘤浸潤性T細胞中K+的細胞內濃度升高到比正常水平更高的水平，從而導致其營養(yǎng)攝入受到限制（152）。此外，T細胞中的這種積聚下調了它們的蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素的哺乳動物靶標（mTOR）信號，并干擾T細胞活化信號（152）。研究人員表明，過表達的K+通道可起到降低細胞內K+含量升高，促進Akt/mTOR活性并恢復T細胞效應功能減弱的作用（152）。綜上所述，上述代謝重編程策略或者改善了TME中的T細胞和CAR T細胞反應，活性和效應子功能，或者避免了腫瘤細胞對浸潤T細胞進行的特定TME特異性修飾的負面影響。

簡而言之，這些策略可能以協(xié)同方式應用，以組織更安全的CAR T細胞療法，同時最大限度地發(fā)揮其殺傷腫瘤的功效，這對于那些難以治療的惡性腫瘤患者來說只是個好消息。